Набор реагентов для качественного выявления SARS-СоV-2 методом ОТ-ПЦР в реальном времени «ALSENSE-SARS-CoV-2-RT-qPCR» предназначен для выявления РНК коронавируса 2019-nCoV методом одностадийной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (далее ОТ-ПЦР-РВ) в препаратах нуклеиновых кислот (НК), выделенных из клинических образцов (назальный секрет, мазок из носоглотки, мазок ротоглотки, мокрота, эндотрахеальный аспират, бронхоальвеолярный смыв, осадок мочи, ректальный мазок, плазма, сыворотка крови человека), далее по тексту – набор. Набор детектирует следующие гены: 3 локуса гена orf1ab коронавируса 2019-nCoV и гены S, E и N коронавируса 2019-nCoV.
Область применения: применение в клинической лабораторной диагностике и в научно-исследовательской практике для качественного определения РНК коронавируса 2019-nCoV клинических образцах (назальный секрет, мазок из носоглотки, мазок из ротоглотки, мокрота, эндотрахеальный аспират, бронхоальвеолярный смыв, ректальный мазок, плазма, сыворотка крови человека) в специализированных лабораториях учреждений медицины и здравоохранения. Только для исследований in vitro.
Требования к квалификации пользователей: специалист с высшим или средним специальным медицинским образованием, специалисты, прошедшие обучение на лицензированных курсах специализации по клинико-диагностической лабораторной диагностике.
Функциональное назначение теста, выполняемого с помощью набора — поддержка диагностики ОРВИ, скрининг и эпидемиологический мониторинг для выявления источника инфекции и оценки эффективности лечения.
Показанием к применению набора «ALSENSE-SARS-CoV-2-RT-qPCR» является тестирование пациентов при подозрении на инфицирование коронавирусом 2019-nCoV (например, при наличии высокой температуры, быстрой утомляемости, потери аппетита, кашля (сухого), болей в горле, болей в суставах, головной боли или одышки). К популяциям, подверженным к повышенному риску инфицирования коронавирусом 2019-nCoV, относятся: лица возраста 65 лет и старше; лица с хроническими сердечно-сосудистыми или цереброваскулярными заболеваниями, диабетом; лица, с онкологическими заболеваниями.
Демографические и популяционные аспекты применения: рекомендуется применять набор «ALSENSE-SARS-CoV-2-RT-qPCR» для обследования пациентов мужского и женского пола без ограничения возраста.
Противопоказанием к применению набора «ALSENSE-SARS-CoV-2-RT-qPCR» является нарушение целостности упаковки, истекший срок годности, не соблюдение требований инструкции.
Набор «ALSENSE-SARS-CoV-2-RT-qPCR» выпускается в следующей комплектации:
Форма выпуска 4 рассчитана на проведение 48 образцов, форма выпуска 2 – на 96 образцов, включая контрольные образцы. Наборы в форме выпуска 4 и 5 применимы для ручной методики постановки реакций ПЦР. Состав наборов в таблице 3:
Таблица 3. Состав набора (форма выпуска 4 и 5)
| Форма выпуска | Реактив | Объем, мл | Количество |
|
форма выпуска 4,
на 48 тестов |
Буфер ALSENSE реакционный | 0,75 | 1 пробирка |
| ОТ-полимераза ALSENSE | 0,06 | 1 пробирка | |
| ПКО | 0,1 | 1 пробирка | |
| ОКО | 0,5 | 1 пробирка | |
| Паспорт | - | 1 шт. | |
|
форма выпуска 5,
на 96 тестов |
Буфер ALSENSE реакционный | 1,5 | 1 пробирка |
| ОТ-полимераза ALSENSE | 0,12 | 1 пробирка | |
| ПКО | 0,1 | 1 пробирка | |
| ОКО | 0,5 | 1 пробирка | |
| Паспорт | - | 1 шт. |
Реагентов в форме выпуска 4 и 5 достаточно для проведения 4 (четырех) независимых постановок амплификации.
Принцип действия набора реагентов «ALSENSE-SARS-CoV-2-RT-qPCR» заключается в проведении полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией на матрице кДНК предварительно синтезированной на матрице вирусной РНК методом обратной транскрипции. Тест одноэтапный – ферменты для проведения обратной транскрипции и ПЦР содержатся в реакционной смеси, проводятся в блоке одного амплификатора последовательно друг за другом. При этом не требуется участия персонала.
В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определённого участка ДНК при помощи ДНК-полимеразы в искусственных условиях (in vitro). В результате нарабатываются копии ДНК, в количестве достаточном для достоверного определения результата. В ходе реакции копируется только заданный участок ДНК, удовлетворяющий условиям специфичности, заложенным в структуре праймеров и флуоресцентного зонда, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.
Гибридизационный зонд содержит одновременно в своей структуре флуоресцентный краситель и тушитель флуоресценции. В случае положительной реакции гибридизационный зонд отжигается на копиях заданного участка ДНК и в следующем цикле ПЦР реакции разрушается полимеразой, что сопровождается выделением красителя, и флуоресценция смеси возрастает.
Данная флуоресценция измеряется детектирующим амплификатором в режиме реального времени параллельно на нескольких каналах. В состав ДНК-зонда, использующегося для детекции продуктов амплификации фрагмента генома коронавируса 2019-nCoV включена флуоресцентная метка FAM/канал Green и ROX /канал Orange (таблица 2).
Необходимым условием качественного анализа является исполнение всех требований преаналитического этапа исследования. Показателем правильного взятия биоматериала является достаточное количество геномной РНК человека в пробе, которое контролируется показателем КБ (контроль биоматериала). Источником этой РНК являются клетки человека, попадающие в пробу при правильной технике взятия биоматериала. В состав ДНК-зонда, использующегося для детекции продукта амплификации КБ, входит флуоресцентный краситель HEX/канал Yellow (таблица 2). КБ является внутренним контролем для оценки эффективности протекания полимеразной цепной реакции в каждом образце при постановке теста.
Таблица 2. Каналы детекции продуктов амплификации
| Канал для флуорофора | Наименование мишени |
| FAM/Green канал | 3 локуса гена orf1ab коронавируса 2019-nCoV |
| ROX/ Orange канал | гены S, E и N коронавируса 2019-nCoV |
| HEX/Yellow | КБ (РНК рибонуклеазы Р человека) |
Выявление РНК коронавируса 2019-nCoV в исследуемых образцах состоит из трех этапов:
- экстракция РНК;
- синтез кДНК с матрицы РНК коронавируса 2019-nCoV;
- амплификация специфических участков кДНК методом ПЦР с одновременной гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».
Набор реагентов одновременно (одномоментно) выявляет РНК вируса коронавируса 2019-nCoV (наличие или отсутствие сигнала по соответствующему каналу флуоресценции), и позволяет пользователю интерпретировать результат.
Интерпретация проходит в два этапа:
- Оценка биоматериала (КБ) — валидно/невалидно;
- Оценка специфики — обнаружено/не обнаружено.