Заботясь о том, чтобы полученный результат был максимально быстрым и точным, собрали для Вас пять статей от производителя " Beckman Coulter", в которых расскажем об:
- относительном центробежном ускорении;- разделении частиц;
- типах роторов для центрифуг;
- воспроизведении протоколов центрифугирования;
- K-факторе
Разделение частиц
Центрифугирование позволяет не только значительно ускорить процесс осаждения, но и разделить суспензию частиц на фракции в зависимости от их размера, плотности и коэффициента седиментации.
Разделение осаждением
Поле центробежных сил можно использовать для разделения частиц, входящих в состав смеси, – например, клеток в составе крови.
Кровь состоит из плазмы (которая представляет собой водный раствор большого количества компонентов) и нескольких типов суспендированных частиц: эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов. Эти клетки – относительно большие биологические объекты, и они достаточно велики для того, чтобы за ночь при условии отсутствия тромбообразования отделиться от плазмы и осесть под действием одной лишь силы тяжести Земли. Но процесс осаждения можно ускорить: если центрифугировать кровь при 1 500 х g, то разделение клеток и плазмы произойдет за 10 мин.
Почему в центробежном поле это происходит так быстро? Потому что сила, которая перемещает каждую клетку от центра вращения к периферии, во много раз больше (в 1 500 раз в примере выше) ее собственного веса в нормальном гравитационном поле Земли.
Все клетки оседают по-разному: крупные быстрее мелких. Поэтому клетки, у которых имеется достаточная разница в размере и скорости седиментации, можно отделить друг от друга.
Например, тромбоциты намного меньше эритроцитов и лейкоцитов, поэтому их можно отделить от этих клеток крови. Все, что для этого нужно, – выбрать правильную комбинацию относительного центробежного ускорения (RCF) и времени центрифугирования. Если центрифугировать кровь при 2 900 х g всего 3 минуты, тромбоциты, в отличие от крупных клеток, не успеют осесть на дно, и их можно будет собрать из верхней фракции, которая будет представлять собой обогащенную тромбоцитами плазму.
На дне пробирки или контейнера в результате центрифугирования образуется осадок или седимент частиц. Жидкость над осадком называется супернатантом. Из него можно собрать достаточно чистую фракцию самых маленьких частиц (см. рис.). При этом осадок из более крупных частиц всегда будет содержать самые мелкие частицы, которые находились на дне пробирки еще до начала центрифугирования. Варьируя скорость и время центрифугирования, можно разделить и собрать из смеси частицы разных размеров. Этот метод называется «дифференциальным центрифугированием».
Осаждение частиц в поле центробежных сил
Разделение по плотности
Плотность – еще одна физическая характеристика частиц и клеток, которую можно использовать с целью их разделения.
Давайте сравним яблоко и камень, имеющие одинаковые размеры и форму. В воде такой камень будет тонуть, а фрукт – плавать. Единица объема камня имеет гораздо большую массу, чем единица объема яблока. Если сказать по-другому, плотность камня выше плотности яблока. Плотность выражается в единицах массы, приходящейся на единицу объема, например, в граммах на миллилитры (г/мл). Плотность воды равна 1 г/мл.
Центробежные силы способны разделить частицы, даже слабо отличающиеся по плотности. Все, что для этого нужно, - подобрать плотность жидкости, в которой будет происходить осаждение таким образом, чтобы менее плотные частицы в ней всплывали, а более плотные – тонули.
Такой метод часто используется для отделения лимфоцитов (разновидность лейкоцитов). Они схожи по размерам с клетками крови других типов и поэтому не могут быть отделены обычным методом осаждения. Однако плотность лимфоцитов ниже, чем у других клеток. Если образец крови нанести поверх жидкости с плотностью 1 077 г/мл, а затем центрифугировать, то лимфоциты сформируют плавучий бэнд, отделенный от большинства других белых и красных клеток, которые, имея плотность выше 1 077 г/мл, сформируют осадок на дне пробирки. Плазма и тромбоциты, имеющие самую низкую плотность, переместятся в верхнюю часть пробирки, как показано на рисунке.
Разделение лимфоцитов по плотности: слева – пробирка до центрифугирования, справа – пробирка после центрифугирования
Посмотрите и другие статьи по принципам центрифугирования от Beckman Coulter:
Относительное центробежное ускорение
Типы роторов
Воспроизведение протоколов центрифугирования
K-фактор